FAQ(よくあるご質問)

Quality Check

1. QC全般について

Q1-1 HoldとFail判定の違いを教えてください。

Hold判定はマクロジェン社基準値を下回っておりますが、そのまま進めても問題なく進行できる可能性が高い状態を示しております。Fail判定は可能であれば再送をお勧めしております。ただし、どちらもマクロジェン社基準値を下回っているため、その後の結果保証はいたしかねます。

Q1-2 QCに使用する液量を教えてください。

通常、2-3 uL使用します。再泳動などを行う場合はもう少し多く使用する場合がございますため、予めご了承ください。

Q1-3 もっとたくさん液量を送ったはずなのですが。

QCレポートに記載のFinal VolumeはQC後の液量です。QCには通常、2-3 uL使用します。
また、チップロスなどを考慮し、さらに2-3 uL引いた量を記載しております。サンプル送付時の液量が少ない場合、冷凍状態で発送いただいてもマクロジェン社到着時に蒸発により枯渇している場合がございますので、余裕をもった液量のご送付をお願いいたします。

Q1-4 サンプルを希釈している理由を教えてください。

液量が不足すると思われる場合、もしくは濃度が高い場合は適宜希釈を行っております。

Q1-5 サンプルを再送したいのですが、費用は発生しますか。

同一サンプルに対し、2回までのQCは無償で行っております。
再再送(3回目のQC)をご希望されます場合はサンプルQC費用が追加となります。ただし、途中でキャンセルされた場合は、実施した回数分のQC費用がご請求となります。

Q1-6 再送の期限はありますか。

基本的にはQC結果をご報告した日から3か月以内での再送をお願いしております。

Q1-7 再送したいのですが、初回サンプルも捨てないでください。

納品後3か月までは、使用しなかったサンプルも保管いたします。

Q1-8 再送サンプルのQC結果次第では初回サンプルを使用して進めてください。

再送サンプルのQC結果がHold, Fail判定でした場合、進行方法について確認のご連絡を差し上げますので、その際に担当者へ初回サンプルでの進行のご指示をお願いします。

Q1-9 再送の方法を教えてください。

オーダーシートの【A】Sequencing information シートで発送種類を「再送サンプル」としていただき、その右側の空白セルに受託番号をご記入いただいた上で印刷、サンプルへ同梱をお願いいたします。
その他の手順は初回サンプルをお送りいただいた際と同様です。※受託番号とは、QCレポート内の「Order Number」のことです。

Q1-10 一度サンプルを返送いただいてから再調整、サンプル再送を行いたいです。

可能ですが、サンプル返送費用が追加となります。1回の返送に対して費用が発生しますので、解析終了後に再度サンプルの返送をご希望いただく場合は返送費用は2回分必要です。

Q1-11 Failサンプルだけでなく、Passサンプルも再送したいです。

可能ですが、場合によってはPassサンプルは次のステップへ進行している可能性がございます。なるべくお早めにご相談ください。

Q1-12 QC結果が悪かったサンプルの代わりに、同じサンプルではなく別のサンプルを送付したいです。

差し替えサンプルをご送付いただくことは可能です。一つのサンプルに対し2回までのQCを無償で対応といたしますため、同じサンプル数の再送であれば追加費用は発生いたしません。

Q1-13 1サンプルに対し同時に2サンプルを送付・QC結果を確認後、シーケンスを行うサンプルを選択したいです。

基本的にはシーケンスに進めるサンプル数と同じ数のサンプルのみをご送付ください。
もしシーケンスするサンプル数以上のサンプルを同時にQCを行う場合は、追加QC費用を頂戴いたします。

Q1-14 初回サンプルと再送サンプルを混合して進めたいです。

再送サンプルに対して単独でQCを行い、QC結果をご報告の際にご指示をいただけましたら初回サンプルと混合してライブラリ調整に進めることが可能です。※ライブラリの混合はいたしかねます。

Q1-15 事前に測定した濃度との違いが大きいです。

マクロジェン社でのサンプルQCにおける濃度測定は、蛍光法による定量を行っておりますので、Nano Dropで事前測定いただいた場合は、濃度に乖離が生じる可能性がございます。お客様の測定方法、条件とは異なる場合がございますため、マクロジェン社でのQC結果を基準としてご案内しております。予めご了承ください。

Q1-16 事前にQCをせずにサンプルを送ってもいいですか。

マクロジェン社でサンプルQCを実施いたしますので、マクロジェン社でのサンプルQC結果をもとにその後の進行について
ご検討いただくことが可能でございますが、途中でキャンセルなさいます場合はそれまでの費用をご請求いたします。

Q1-17 微量サンプルのため、サンプルQCは省略し、全量を使用してライブラリ作製をお願いしたいです。

ご希望いただいた場合はQCを省略することは可能ですが、この場合の結果保証はいたしかねます。

Q1-18 ライブラリ調製時のinput DNA / RNA量を教えてください。

基本的にはサンプルQC基準値の量がinput量です。基準値以下のサンプルは全量使用します。分解が進んでいるサンプルは通常よりinput量を増やして進行することでライブラリ調整が成功する可能性もございますが、結果保証はいたしかねます。各キットごとの基準値については、オーダーシートにてご確認ください。

Q1-19 DNA / RNA 量が基準値未満ですが、このまま進めたいです。

ライブラリ濃度が低くなり、取得データ量が予定より少なくなる可能性がございます。
量がマクロジェン社の基準値未満の場合でも、分解が進んでおらず、メーカーが提示しております、最小input量以上であれば進行可能な可能性もございます。ただし、マクロジェン社の基準値は満たしていないため結果の保証はいたしかねます。また、ライブラリ調整後のQC結果においてライブラリ濃度がかなり低く、シーケンス進行が難しい場合でも、ライブラリ調整費用まではご請求させていただくことになりますので、リスクを承知いただいた上で進行のご指示をお願いします。

Q1-20 一部のサンプルのみ進行し、その結果を確認してから残りのサンプルの進行を決めたいです。

可能ですので担当者へお申し付けください。
ただし、先行結果納品後、なるべくお早めに残りのサンプルの進行方法についてご指示をお願いします。
またHDD納品の場合は、先行納品に使用したHDDをマクロジェン社まで返送いただく必要がございます。

Q1-21 お勧めの抽出キットはありますか。

生物種によって最適な抽出手法が異なるため、基本的には推奨はございません。動物細胞などではカラム精製を実施するキット、植物細胞などではCTAB法などを実施することが一般的かと存じます。

2.RNA QC について

Q2-1 RIN (RNA Integrity Number) とはなんでしょうか。

RNAの分解の進行度合いを1.0~10.0の数値で表したものです。泳動結果をrRNAやrRNAの分解物が出現する領域などの9つの領域に細分化し、それぞれの状態を数値化します。それらの数値に領域毎の重み付けを行った後、分解度を10点満点で表示します。マクロジェン社の基準は7.0以上で、数値が低いほど分解が進んでいます。

Q2-2 rRNA ratio (%) とはなんでしょうか。

28Sと18Sピーク、または23Sと16Sピークの比率です。
RIN値と併せて分解の程度を評価する指標として使用しており、マクロジェン社の基準値は1.0以上です。分解が生じると28S (または23S) ピークの割合が小さくなり、18S (または16S) ピークの割合が大きくなります。また生物種によっては28Sピークが確認できず、18Sのみのシングルピークとなります。
RIN値が問題なければ通常通り進行可能と思われますが、結果の保証はいたしかねます。

Q2-3 RINとrRNA ratioが0.1となっています。事前測定ではもっと高かったのですが。

濃度が低く、測定不能のため0.1としております。実際の数値は申し訳ございませんがわかりかねます。

Q2-4 DV200 (%) とはなんでしょうか。

200 bp以上のRNAの割合のことで、DV200の値が小さいと断片化が進んでいると考えられます。
マクロジェン社の基準は50%以上です。

Q2-5 5s peak(small peak)とはなんでしょうか。

低分子域にみられるピークを指しております。tRNA由来のピークであることも多いようですが、明確な由来は分かりかねます。

Q2-6 DNA混入の疑いと判定された理由はなんでしょうか。またこのまま進めた場合のリスクを教えてください。

28Sまたは23Sピークより高分子域にピークが確認された場合、DNA混入の疑いと判定しております。
このまま進めた場合、結果にDNA由来のリードが含まれる可能性がございます。マクロジェン社で有償にてDNase処理を行うことは可能ですが、作業結果の保証はいたしかねます。また、Small RNA-Sequenceのご依頼の際はDNase処理には対応しておりません。mRNAをoligo dTでCaptureするライブラリ調整方法などの場合、理論的にはDNase処理を行わなくてもコンタミによる影響は最小限になると考えられますが、実際どの程度影響があるかはわかりかねます。
また、DNA混入がある場合、正確にRNA濃度が測定できていない可能性がございますので、実際のRNA量はレポート記載量より少ないかもしれません。

Q2-7 分解が進んでいますが、このまま進めた場合のリスクを教えてください。

十分なライブラリ濃度が得られなかったり、シーケンスへ進行しても、取得データ量が少なくなったりする可能性がございます。またmRNAをoligo dTでCaptureするライブラリ調整方法の場合、全長がシーケンスされずリードが3’側に偏る、3’ biasと呼ばれる現象が生じる可能性もございます。
一般的に問題ないとされるRNAの状態がRIN値7.0であり、分解が進むほど、3’ biasの傾向が強まります。3’ biasのデータ解析への影響としましては、例えば発現比較解析時ですと、実際には同じような発現量を持っていたとしても、biasによるread損失のため、Expression estimation, DEG analysis に不備が生じ、結果の信頼性が下がる可能性がございます。random priming によるライブラリ調整方法の場合、rRNAが除去しきれず、rRNA由来のreadの割合が高くなる可能性がございます。

Q2-8 分解が進んでいますが、キットを変更して進めることはできますか。

random priming によるライブラリ調整方法の場合、mRNAをoligo dTでCaptureするライブラリ調整方法に比べて、分解傾向のあるサンプルでも対応できる可能性がございます。しかし、分解が進んでしまっている場合はrRNAが除去しきれず、rRNA由来のreadの割合が高くなる可能性がございます。
Humanサンプルであれば、TruSeq RNA Exome kit も使用可能です。こちらはコーディングRNAを配列特異的にキャプチャーするキットのため、ある程度であれば分解の進んだサンプルでも解析が可能となります。

※プローブがデザインされていないRNAはシーケンスされません。※過去案件とのデータ比較などを行う場合は、仕様(ライブラリ調整kit)を統一することをお勧めします。

Q2-9 分解が進んでいる理由として何が考えられますか。

RNAの分解が進んでいる理由に関して主に以下の原因が考えられます。
・サンプリング状況でRNAの分解が進行してしまった。
→サンプル採取後すぐに液体窒素で凍結させて、融解する前にフェノールや抽出Bufferを加えるなどで対策いただけるかと思われます。

その他にも様々な原因の可能性がございます。
RNAは基本的に分解し易い核酸であるため、ご留意ください。

Q2-10 凍結させる組織の大きさはRNAの質に影響しますか。

組織が大きすぎて、内部まで完全に凍結するのに時間がかかってしまう場合などは、RNaseが不活化する前に組織内のRNAが分解してしまうこともございます。凍結前の組織片が大きい場合などは、多少切断していただいてから凍結していただくことで、分解が防げる場合もございます。

3.DNA / PCR産物QC について

Q3-1 DNA精製をしていただけますか。

有償ですが可能です。
ただし微量サンプルの場合は、抽出過程でサンプルをロスする可能性がございますので、量が十分に無いサンプルに対してはお勧めしておりません。

Q3-2 DIN (DNA Integrity Number) とはなんでしょうか。

gDNAの分解の進行度合いを1.0~10.0の数値で表したものです。数値が低いほど分解が進んでいます。

Q3-3 DIN値が低かったですが、再抽出時、気を付ける点があれば教えてください。

サンプル採集から抽出までを素早く行っていただくことが重要かと思われます。
凍結融解を繰り返すと分解が進む可能性がございますので、その点もご注意ください。なお、FFPE由来のサンプルや、メタゲノムサンプルの場合はDIN値が低い特異性がございますので改善は難しいです。
DIN値の改善が難しい場合はPCR増幅を行うライブラリ作製キットでの進行をご相談ください。

Q3-4 PCR増幅がされないのはなぜでしょうか。

Bufferの塩濃度や残留有機物等でPCR増幅がされづらいこともございます。
実際にどの要素がPCRを阻害しているかは判断が難しいです。またPCRを行うには十分な濃度があり、サンプルQCでPass判定となった場合でもPCR増幅がうまくされないことがございます。
この場合でもPCR費用はご請求となりますので何卒ご了承ください。

4. Library QC について

Q4-1 Library QCの内容を教えてください。

qPCRでの濃度測定、およびTapeStationまたはBioanalyzerを用いたサイズ確認を行っております。

Q4-2 事前に測定したサイズとQC結果のサイズに乖離があります。

泳動に使用する機器やチップの種類により、誤差が生じる場合がございます。

Q4-3 Multi peak (broad peak, high molecular Peak)とのことですが、このまま進めても問題ないですか。

Multi peakはライブラリ調整キットに依存するものなど、特に問題無い場合もございますが、目的のピークかどうかマクロジェン社で判断しきれない部分もございますので、必ず一度お客様にピークをご確認いただき、進行のご指示をいただいた後でシーケンスへ進みます。
もし目的外のピークが確認された場合、そのピーク由来のリードが結果に含まれる可能性がございます。

Q4-4 small peak (adapter dimer) とはどのピークのことですか。また結果にどのような影響がありますか。

Lower marker とメインピークの間の低分子域に確認された小さいピークのことです。
一般的に低分子域の方がシーケンスされやすい傾向があるためHold判定になります。
メインピークがはっきりしている場合は大きな影響はないと思われますが、結果の保証はいたしかねます。

Q4-5 濃度が基準値未満ですが、シーケンスは可能ですか。

2.5 nM以上であれば問題なくデータが取得できる場合が多いです。
2.5 nM未満の濃度でもシーケンスは可能ですが、取得データ量が少なくなる、またはほとんど得られない可能性がございます。※ライブラリお預かりの場合は取得データ量の保証はいたしかねます。

Q4-6 濃度が低いので追加で送るサンプルと混合して進めていただけますか。

申し訳ございませんが、ライブラリの濃縮は承っていないため混合しても濃度を改善することはできません。お手数ですがお客様の元で再調整を行っていただき、サンプルの再送をお願いいたします。
※一度返送をご希望されます場合は返送費用が追加となります。(Q1-10参照)

Q4-7 濃縮してシーケンスへ進めていただけますか。

申し訳ございませんが、ライブラリの濃縮は承っておりません。

Q4-8 精製を行っていただけますか。

申し訳ございませんが、ライブラリの精製は承っておりません。

Q4-9 Poolingはどのように行いますか。

特にご指定が無い場合、Library QCでの測定値をもとに、等モル比で混合いたします。

Q4-10 ライブラリQC結果の報告が送られてきません。

ライブラリQC結果のご報告は、ライブラリをご送付いただいた場合など、一部の案件でのみご報告をしております。gDNA / RNAなどをご送付いただき、サンプルQCを行った案件のライブラリQC結果についてはライブラリ濃度が低いなどの問題が発生した場合のみにお送りし、進め方についてご相談しております。
問題が無かった場合は基本的にはお送りしておりません。

5. BioChipQC について

Q5-1 濃縮は可能ですか。

可能ですが、液量が十分に無い場合は対応いたしかねますので、追加でサンプルをお送りいただく場合もございます。

Q5-2 RNA混入疑いとのことですが、RNase処理をお願いできますか。

RNase処理後の作業結果は保証いたしかねますが、有償にて対応可能です。
RNase処理を行うと、その過程でDNA損失が生じますため、可能であれば、サンプルの再送をお勧めしております。また再送が難しく、若干のRNAコンタミであれば、結果の保証はいたしかねますが、RNase処理は行わず、そのまま解析進行することをお勧めいたします。

Q5-3 純度が低いですが、精製をお願いできますか。

有償にて対応可能ですが、精製を行うと、その過程でRNAサンプルの損失が生じますので、可能であれば、サンプルの再送をお勧めしております。

6. Cancer Panel QC について

Q6-1 純度が低いですが、精製をお願いできますか。

有償にて対応可能ですが、精製を行うと、その過程でDNAサンプルの損失が生じますので、可能であれば、サンプルの再送をお勧めしております。

Q6-2 再度サンプルを調整したのですが(FFPEからのゲノム抽出)、純度が2.0以上と高く出てしまいます。何か対応策はありますか。

FFPE由来サンプルの場合、DNAが分解していることが予測されるため、純度が重要な指標の一つとなります。A260/280が1.8以下の場合は、タンパクやフェノールなどが残留していると考えられ、2.0以上の場合はその他の不純物が混入しているといわれています。
しかし、マクロジェン社では「その他の不純物」を特定することが難しいため、有効な精製方法などのご案内が難しい状況です。RNA除去、エタノール沈殿などで多少の改善がみられることもございますが、複数回実施しても改善されない場合もあるようです。

Result

1.納品結果md5sum値について

Q1-1 md5sum値とはなんですか。

md5(Message Digest 5)はハッシュ関数の一つでファイルやデータを数学的に圧縮した場合にハッシュ値を生成します。結果データをダウンロードもしくはコピーしたあとに、正しくダウンロード、コピーされたかを確認するため、「md5sum値」のご確認をお願いしております。

Q1-2 md5sum値が一致しません。

正しくデータがダウンロードまたはコピーできていない可能性がございます。再度データのダウンロードまたはコピーをお願いいたします。データダウンロード時にGoogle Chrome以外のブラウザと相性があまり良くない傾向がございます。Google Chrome以外のブラウザをご利用の場合は一度既定のブラウザをGoogle Chromeに変更しダウンロードをお試しください。

Q1-3 md5sum値の確認方法について教えて下さい。

「QuickHash-Windows」という、フリーのアプリケーションがございます。もしお手持ちのソフトウェアが無ければこちらをご取得下さい。
https://www.quickhash-gui.org/downloads/
アプリケーションを起動後、Fileタブをご選択いただき、AlgorithmはMD5をご選択ください。
「Select File」をクリックし、md5sumの値の確認を行うファイルをご選択ください。表示された数字と、PDFレポートのダウンロードリンクの右側に記載されたmd5sum値の数字が一致することが確認できましたら作業完了です。Expected Hash Valueの欄に記載されたmd5sum値を入力いただくと、数字が一致しているかご確認いただけます。

2. 納品結果fastqfileについて

Q2-1 fastqfileとはなんですか。

「fastqfile」は、シーケンサーから出力されたbclファイルから生成されたデータ解析に用いる前の生データを指し、そのままですと中身を見ることはできません。一般的には、データ解析専用のソフトウェアにインプットするファイルでございます。データ解析までご依頼されましたお客様はデータ解析結果のみではなく必ずfastqfileについてもお忘れなくご取得をお願いいたします。(データが消えますと追加解析を承れません。)

Q2-2 fastqfileを使用するソフトウェアについて教えて下さい。

ソフトウェアは、ご研究の目的、解析のアプリケーションによって、有償、無償、様々なものがございます。また、シーケンスデータは容量が大きいため、解析にはLinux等、専用のPC環境を用いられる場合が多いです。

Q2-3 fastq.gz fileの解凍方法について教えて下さい。

fastqfileは7Zipファイルの展開ソフトで展開できますので、下記URLよりソフトのダウンロードと展開をお試しください。https://7-zip.opensource.jp/

Q2-4 fastqfileをダウンロードしましたがサイズが小さいです。

ダウンロードが正しくできていない可能性がございます。
データダウンロード時にGoogle Chrome以外のブラウザと相性があまり良くない傾向がございます。Google Chrome以外のブラウザをご利用の場合は一度Google Chromeでのダウンロードをお願いいたします。ダウンロードしたファイルはmd5sum値の確認もお願いいたします。また、大学・施設のサーバー環境によっては一定のデータ量でダウンロードが止まってしまうことがあるようです。
もし可能でしたら別の環境でもお試しいただけますと幸いです。

Q2-5 fastq.gz fileをダウンロードしていますが終わりません。

fastqfileはデータ量が多いためダウンロードにお時間がかかります。また、時間帯によってアクセスが集中する場合がございますため、少し時間を置く、もしくは夜間のダウンロードをお試しいただけますと幸いです。お客様の環境によってはダウンロードデータ量で制限される場合がございますため、ネットワーク環境のご確認をお願いいたします。

Q2-6 fastqfileのダウンロードができません。(Not Foundと表示される)

マクロジェン社ではサーバー負荷軽減のため、納品後約2週間で納品レポートのダウンロードリンクをクローズしております。データ保管期限内である納品後3ヶ月以内であれば再開通の手配をいたしますのでお手数ですが、【bio@apro-s.com】までご連絡ください。

Q2-7 ダウンロード期限を過ぎてしまったがダウンロードしたいです。

納品後3ヶ月が経過しますとマクロジェン社サーバーからデータが完全に削除されます。
恐れ入りますが、3ヶ月を過ぎてデータの再取得が必要な場合はサンプルをご送付いただき再実験をする必要があります(追加費用が発生いたします)。

Q2-8 アダプター配列について教えて下さい。

キット毎に異なりますため【bio@apro-s.com】までお問い合わせください。

3. 納品結果HDD納品について

Q3-1 パスワードの案内メールがきていないです。

HDD発送時にHDD受取先のお客様(代理店様)にパスワードのご案内メールをご送付しております。
マクロジェン社もしくは代理店様よりパスワードのご案内メールをお送りできていない場合は恐れ入りますが、【bio@apro-s.com】までご連絡ください。

Q3-2 パスワードを入力したがエラーになります。

パスワードをコピーした際にスペースなどが含まれていますと解除できません。
20文字を入力していただいているかご確認いただき、解除ができない場合はお手数ですが、【bio@apro-s.com】までご連絡ください。

Q3-3 パスワードを入力したが解除が完了しません。

パスワードを入力してから解除まで10分ほどお時間がかかる場合がございます。
恐れ入りますが、解除が完了するまでお待ちいただけますと幸いです。

4. 納品結果解析物について

Q4-1 どのファイルをダウンロードすればいいですか。

解析結果のZipファイルだけでなく、「Data Download Information」のRaw dataファイル(fastq.gzファイル)も全てダウンロードをお願いいたします。後日追加解析を依頼される際(納品後3ヶ月以上経過している場合)に、これらのファイルを提供していただく必要があります。
また、公共DBに結果を登録する際もfastqファイルが必要になります。

Q4-2 解析結果を見たがファイルが見れません。

解析結果ファイルはZipファイルのため、展開してからのご確認をお願いしております。

Q4-3 解析結果内のhtmlレポートの画像が表示されません。

ダウンロードが正しくできていない可能性がございます。
データダウンロード時にGoogle Chrome以外のブラウザと相性があまり良くない傾向がございます。Google Chrome以外のブラウザをご利用の場合は一度Google Chromeでのダウンロードをお試しください。また、解析結果ファイルはZipファイルのため、ファイルを展開してからのご確認をお願いしております。展開後、フォルダ内の構成を編集しないでご確認ください。

Q4-4 Raw dataが2個ずつあるのはなぜですか。

Paired endでの解析を行っている場合は、1サンプルにつき2つのファイル(read1, read2)を納品しております。

Q4-5 vcfファイルの確認方法について教えて下さい。

Excelプログラムを開いていただき、vcfファイルをそのままExcelにドラッグアンドドロップしましたらデータをご確認いただけます。

Q4-6 PDFレポートが複数あるがダウンロードするファイルは片方のみで大丈夫ですか。

比較パターンによりレポートが複数に分かれていることがございます。どちらかのレポートからRaw Dataの「Fastq.gz」を、各レポートからAnalysis Resultsの「_RNAseq.zip」及び「_RNAseq_excel.zip」についてダウンロードをお願いいたします。